重組MIX是一款簡(jiǎn)單、快速、高效的多片段DNA定向克隆產(chǎn)品，本試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。將載體在克隆位點(diǎn)進(jìn)行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)的完全一致的序列(20 bp～40 bp)。將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合，在重組酶的催化下，僅需反應(yīng)15-60 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆?？寺￡?yáng)性率可達(dá)90%以上。
試劑盒中2×重組MIX預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了特殊成分，可顯著提高重組克隆效率，可以一次實(shí)現(xiàn)多至6個(gè)片段的順序拼接克隆。
應(yīng)用：
? 多片段克隆到目標(biāo)載體
? 多片段組裝后作為PCR或RCA的模板
產(chǎn)品特點(diǎn)：
? 簡(jiǎn)單高效的定向無(wú)縫克隆
? 靈活的序列設(shè)計(jì)，無(wú)需考慮酶切位點(diǎn)
? 無(wú)需PCR純化步驟
? 可同時(shí)進(jìn)行最多6個(gè)DNA片段的組裝
質(zhì)量控制檢測(cè) ：
使用Positive control組裝五個(gè)DNA片段，涂布于CI抗性平板上，最終用菌落PCR或質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆達(dá)到87.5%及以上。
使用說(shuō)明
1、反應(yīng)體系
冰上配制如下反應(yīng)體系。
2×重組MIX 10 μL
線性化克隆載體 A ng
插入片度（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ） B ng
ddH2O Up to 20μL
注：如果不慎將液體粘在管壁，可通過(guò)短暫離心使其沉入管底；
重組Mix重組反應(yīng)體系最適DNA使用量為每線性化片段0.03pmol。該摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計(jì)算獲得：片段添加量（ng）= 0.02×片段堿基對(duì)數(shù)（bp）（對(duì)應(yīng)的片段濃度為0.03 pmol）。
2、重組反應(yīng)
（1）在冰上解凍2×重組Mix，顛倒混勻。
（2）在無(wú)菌管中加入載體和片段（按上述要求），用無(wú)菌水補(bǔ)足到10μL，最后加入10 μL 2×重組Mix，用移液器輕輕吸打混勻避免氣泡產(chǎn)生。
（3）50℃恒溫反應(yīng)15-50min，2-3個(gè)片段15min反應(yīng)即可，4-6個(gè)片段需反應(yīng)60min，在冰上放置3-5min。
3、轉(zhuǎn)化
（1）取化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍。
（2）取上述反應(yīng)液10 μL加入到感受態(tài)細(xì)胞中充分混勻。冰浴10min。
（3）將離心管置于42℃水浴鍋中熱激90s，然后迅速放回冰上，使細(xì)胞冷卻2～3min。
（4）向離心管中加入已預(yù)熱的無(wú)菌LB(或SOC)培養(yǎng)液600μL，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)45～60min。
（5）短暫離心棄上清，吸取100 μL的新鮮LB培養(yǎng)基重新懸浮，將菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
4、 克隆鑒定
菌落PCR。用無(wú)菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至20～50μL LB 培養(yǎng)基中混勻，直接取1μL作為PCR模板，使用2×Taq DNA Polymerase Master進(jìn)性菌落PCR實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
? 為達(dá)到最優(yōu)的重組效果，請(qǐng)保證體系中PCR片段和載體的質(zhì)量，建議DNA樣品A260/280>1.8，濃度>40ng/ul。
? 多片段重組時(shí)，相鄰兩個(gè)DNA片段有互不相同的20-40bp同源序列，確保定向組裝。同源序列的長(zhǎng)度由片段數(shù)目和長(zhǎng)度決定，多片段重組建議設(shè)計(jì)40bp同源序列。同源序列需要避免重復(fù)序列、復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)以及高低GC區(qū)域。
? 當(dāng)?shù)玫降腜CR產(chǎn)物條帶單一時(shí)，可無(wú)需純化，產(chǎn)物可直接用于重組，注意產(chǎn)物添加量不可超過(guò)重組體系的1/10。
? EDTA等金屬離子螯合劑對(duì)該產(chǎn)品有抑制作用，必須保證反應(yīng)體系中不含該類(lèi)螯合劑。